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免疫組庫測序

        免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是指某個個體在任何特定時間點其循環系統中所有功能多樣性B淋巴細胞和T淋巴細胞的總和。T細胞和B細胞分別介導機體的細胞免疫和體液免疫應答,分別通過其表面的T細胞受體(TCR)和 B細胞受體(BCR)來識別和結合抗原,進而發揮功能清除病原體或體內腫瘤細胞。


        免疫組庫高通量測序是通過多重PCR或SMART RACE法擴增TCR/BCR全長或CDR3區序列(主要是TCR的β鏈或BCR的重鏈),再結合高通量測序技術,對機體免疫組庫的多樣性及每種 T、B細胞克隆的獨特性序列組成和變化進行分析,從而全面評估機體的免疫狀態,明確疾病與T、B細胞克隆組成及變化之間的關系。隨著免疫組庫高通量測序技術的不斷發展和成熟,基于免疫組庫多樣性變化特點的生物標志物發現、腫瘤等疾病療效預測、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要進展。


實驗方案
        測序策略: Illumina平臺  PE150

        數據量:1G raw date/樣


樣本要求
        (1)分選的T或B細胞:建議細胞數103-107個,離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運輸。
        (2)外周血單個核細胞(PBMC):建議細胞數103-107個,離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運輸。
        (3)新鮮全血:采集外周血于EDTA抗凝管內,混勻后取 250μl,保存于750μl Trizol LS并混勻,低溫保存運輸。
        (4)組織:取50~100mg組織,保存于1ml Trizol中,低溫保存運輸。

        (5) 如果客戶自提 RNA,建議最好用進口試劑或試劑盒提取,最后溶于無RNA酶的水中。如果是分離的PBMC,RNA濃度大于50ng/μL,總量大于500ng。如果用組織提 RNA,濃度>500ng/μL,總量>5μg。 


技術優勢
        (1)擁有自主發明專利的UMI標記與校正算法(發明專利號:201810618023.7),對PCR擴增與測序過程引入的錯誤與偏倚進行有效糾正,極大提高分析結果的準確度。
        (2)采用當前免疫組庫擴增最有優勢的5' RACE法,保證結果的可靠性和后期研究的方便性;
        (3)針對微量細胞樣本(>100個),可以采用微量建庫技術,大大提高建庫成功率;
        (4)由武漢大學、中山大學、南方醫科大學以及美國斯坦福大學研究人員組成的專業的研究和分析團隊,保證研究結果的可信度和可重復性;

        (5)運用國際認可的專業的免疫組庫分析模塊,并結合我們自己獨有的生物信息分析算法,所提供的標準化的分析流程即可滿足科研或臨床所需。另外我們還可提供數據的深度分析服務(需另收費).


數據分析
        (1)測序數據質量評估
        (2)克隆的鑒定與計數
        (3)不同V/D/J基因的計數、頻率和頻率檢驗
        (4)不同V/D/J基因組合的計數、頻率和頻率檢驗
        (5)有顯著差異的克隆型頻率
        (6)CDR3長度分布
        (7)CDR3氨基酸與核苷酸序列的克隆計數、頻率和有關分析
        (8)樣本間CDR3氨基酸序列的相關性、相似性和多樣性評估

        (9)樣本間共有克隆分析


技術流程

        RNA提取和質檢-SMART RACE法擴增-文庫構建-上機測序-標準信息分析-高級信息分析


案例分析
        案例(1)免疫組庫測序揭示肝癌組織TCR多樣性及其意義(由華銀高通量完成)

        T淋巴細胞通過特異性T細胞受體(TCR)識別抗原肽,在人類適應性免疫應答中扮演著重要角色。TCR多樣性與宿主免疫反應及腫瘤預后密切相關。盡管腫瘤浸潤性T淋巴細胞對腫瘤預后有一定的影響,但很少有研究對乙型肝炎病毒(HBV)相關肝細胞癌(HCC)中的腫瘤組織和非腫瘤組織中的TCR多樣性進行詳細地特性描述。本研究對來自48位HBV相關HCC患者的肝癌腫瘤組織進行免疫組庫測序。與癌旁組織相比,腫瘤組織CDR3氨基酸(aa)克隆型具有顯著較高的平均數(2259 vs.1324,p<0.001),TCR多樣性顯著升高(Gini協同系數,p<0.001;Simpson指數,p<0.01;Shannon熵,p<0.001)。對中央Morisita-Horn相似指數(MHSI)的分析顯示,在腫瘤組織與癌旁組織之間TCR庫相似性較弱。本研究在肝癌患者腫瘤中觀察到T淋巴細胞具有廣泛的異質性,以及在相鄰癌旁組織中有較高的HEC。腫瘤組織和癌旁組織中差異化T細胞庫顯示了乙肝相關性肝癌患者體內獨特的T細胞免疫微環境。 



圖1 腫瘤及癌旁組織中Vβ和Jβ基因片段使用頻率熱圖


圖2 CDR3 aa克隆類型多樣性的分析


        案例(2)大規模t細胞受體測序闡明CD8+淋巴細胞在拉斯穆森腦炎中的致病機理

        拉斯穆森腦炎(Rasmussen encephalitis, RE)是一種罕見的兒科癲癇疾病伴隨有半腦炎癥和進行性神經系統缺陷。為了闡明RE的免疫反應過程,德國明斯克大學神經學研究所對RE患者的22例血液,2例腦脊液,和5例腦組織切片樣本還有兒科樣本參照進行T細胞受體(TCR)測序。RE患者樣本表現為外周CD8+T細胞的擴散程度與疾病的嚴重程度相關。此外,在CNS中,RE是唯一的具有T細胞擴散的兒科癲癇疾病。同時提示在RE中,外周擴散的CD8+淋巴細胞的抗原特異性會侵害CNS,可通過限制其進入CNS來改善。 


圖1RE患者的TCR組庫嚴重受限制


圖2 RE患者特異性的克隆中CDR3區和Vβ基因的長度分布
            

圖3 中樞神經系統干細胞移植前后TCR組庫的情況及不同樣本間共享的克隆類型

        案例(3)個體遺傳差異導致獨特的淋巴細胞受體和抗原細胞

        適應性免疫系統的保護機體的能力是需要不同的淋巴細胞抗原受體完成的。然而個體差異基因和后天因素導致的差異和影響還沒有被完全闡釋。斯坦福大學醫學院通過對5對同卵雙生雙胞胎的B、CD4+ T和CD8+ T淋巴細胞進行分析,來量化遺傳因素在V(D)J重組過程和胸腺選擇中的影響。選取PBMC進行RNA提取后利用反轉錄獲得目的片段并構建免疫組文庫,使用Miseq進行2x300 bp測序,最后分析免疫組庫的差異性。



圖1 遺傳性因素影響的未成熟細胞的基因使用分析圖


圖2 未成熟細胞和記憶細胞的CDR3區域特征遺傳傾向性

參考文獻
[1] Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.   
[2] Schneider-Hohendorf et al. CD8+ T-cell pathogenicity in Rasmussen encephalitis elucidated by large-scale T-cell receptor sequencing. Nature Communications, 2016.                 
[3] Rubelt et al. Individual heritable differences result in unique cell lymphocyte receptor repertoires of na?ve and antigen-experienced cells. Nature Communications, 2016.